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成高子镇中心卫生院检验科

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检 验 科

HIV 筛查实验点 SOP 文件

SOP-MY-HIV-5
第 1 版第 1 次修改 第 65 页 共 70 页

酶标仪的可测范围视各酶标仪的性能而不同。普通的酶标仪在 0.000 ~ 2.000,新型号的酶标仪上限拓宽达 2.900,甚至更高。超出可测上限的 A 值常以 “*”或“over”或其它符号表示。应注意可测范围与线性范围的不同,线性范 围常小于可测范围,比如某一酶标仪的可测范围为 0.000~2.900,而其线性范围 仅 0.000~2.000,这在定量 ELISA 中制作标准曲线时应予注意。 【酶标仪校正程序】 1、滤光片波长精度检查:将不同波长的滤光片从酶标仪上卸下,用 UV-2201 型紫外-可见分光光度计 (波长精度±0.3nm) 于可见光区对每个滤光片进行扫描, 其检测值与标定值之差为滤光片波长精度。一般酶标仪无 585nm 滤光片,可选用 550nm 或 630nm 滤光片。 450nm 滤光片的检定选用普鲁兰溶液(校正波长为 630nm) 。 2、通道差与孔间差检测:通道差检测是取一只酶标板小孔杯(杯底须光滑, 透明, 无污染) 以酶标板架作载体, 将其 (内含 200ul 甲基橙溶液吸光度调至 0.500A 左右)置于 8 个通道的相应位置,蒸馏水调零,于 490nm 处连续测三次,观察其 不同通道的检测器测量结果的一致性,可用极差值来表示。孔间差的测量是选择 同一厂家,同一批号酶标 2 板条(8 条共 96 孔)分别加入 200ul 甲基橙溶液(吸 光度调至 0.100A 左右)先后置于同一通道,蒸馏水调零,于 490nm 处检测,其误 差大小用±1.96s 衡量。 3、零点飘移(稳定性观察) :取 8 只小孔杯分别置于 8 个通道的相应位置, 均加入 200ul 蒸馏水并调零,于 490nm 处每隔 30 分钟测一次,观察各个通道 4 小时内吸光度的变化。 4、精密度评价:每个通道 3 只小杯分别加入 200ul 高中低 3 种不同浓度的 甲基橙溶解,蒸馏水调零,于 490nm 作双份平行测定,每日测二次(上下午各一 次) ,连续测定 20 天。分别计算其批内精密度,日内批精密度,日间精密度和总 精密度及相应的 CV 值。 5、线性测定:用电子天平精确称取甲基橙配制 5 个系列的溶液,于 490nm 平行测 8 次,取其均值。计算其回归方程,相关系数及标准估计误差 S,并用± 1.96S 表示样品测量的误差范围。双波长测定评价:取一分甲基橙溶液,分别加

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SOP-MY-HIV-5
第 1 版第 1 次修改 第 66 页 共 70 页

入 3 种不同浓度的溶血液(测定波长为 490nm,校正波长为 585nm) ,先后于 8 个 通道检测,每个通道测 3 次,比较各组之间是否具有统计学差异,以考察双波长 消除干扰组分的效果。 【标本的采集和保存】 1、标本采集时应尽量避免溶血,因红细胞破裂可释放过氧化物酶活性物质 干扰立可读方法的结果,以 HRP 为标记的 ELISA 测定中,溶血标本会增加非特异 性显色造成假阳性。 2、细菌污染的标本同样的道理也易产生假阳性,因菌体中可能含有内源性 HRP 也会产生假阳性反应。 3、抗凝不完全的标本因纤维蛋白原的干扰而造成假阳性,建议尽量不用抗 凝血尤其是不使用用肝素抗凝剂。 4、标本在冰箱中保存时间过长易导致血清 IgG 聚合,使间接法的试剂本底 加深,一般血清置 4℃冰箱 5 天内完成测试。如需保存一周以上则要-20℃冰冻保 存,冻结血清融解后,蛋白质局部浓缩,分布不均,融解时应上下颠倒充分混匀, 同时避免气泡。可上下颠倒混和,不要在混匀器上强烈振荡。反复冻融会使抗体 效价跌落,如需保存作多次检测,宜少量分装冰冻保存。 5、ELISA 的灵敏度>1ng/ml 水平上,标本间的污染要尽量避免,尤其不应 与生化试验用同一管标本。 【分析中质控】 ELISA 实验的结果受操作影响很大,每个步骤包括加样,温育,洗涤,显色, 酶标仪读数均应认真负责才能充分发挥 ELISA 的高灵敏,强特异的优点。因此, 应建立实验项目的标准操作程序(SOP)。 一、加样 1、加样应用微量移液器(加样枪)按规定的量加入微孔板底部,避免加在 孔壁上部,不可溅出,不可产生气泡。 2、每次加样应更换吸嘴,做到一人一吸头,以免发生交叉污染;干吸头预先 在血清中抽吸三次。 3、样本稀释,目的是为了减少非特异性反应,所以一定要先加稀释液后加

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第 1 版第 1 次修改 第 67 页 共 70 页

样本,特别注意加样后要在微量振荡器上振荡 30 秒钟,同时注意防止液体溢出。 如后面操作步骤中加二种以上试剂时均需振荡混匀。 4、如用滴瓶滴加试剂应先将滴瓶摇匀并挤去第一滴有气泡的试剂后加样。 二、温育 1、抗原抗体反应需要在一定温度下(37°C) ,经过一定的时间才能达到反 应的平衡点。 2、ELISA 边缘效应是由温育形成的。所以温育一般采用能使反应液温度迅速 达到平衡的水浴法。水要浸至板条的 1/3 处。 3、反应板不宜叠放,注意温育的温度和时间应按规定控制,一个人操作时, 一次不宜多于两块板同时测定。 三、洗涤 1、手工洗涤一般采用浸泡方法:1)甩去孔内反应液; 2)用洗涤液过洗一 遍(即注满孔后即甩去) ;3)微孔重新注满洗液后浸泡 2-3 分钟,间歇摇动;4) 甩去孔内液体,拍板,用纸吸干。重复以上操作至少 5 次。注意各种试剂盒的洗 涤液尽量不要混用。 2、洗板机洗板一定要预先把板架放平,使洗板机上的每个放液和吸液纤孔 都能一致地插入孔底,将孔内液体全部吸干,同时要设置一定的浸泡时间。如出 现机洗后拍板有较多残留液时应再用手工洗 2 次以上。关机前要用蒸溜水冲洗管 道,避免堵孔。 四、显色 1、HRP 催化底物的一步呈色反应,同样需要一定的时间和温度。 2、一定要按照说明书规定的时间温度(一般为 37°C,10-15 分钟)恒定反 应后终止。 3、或根据临界值质控血清吸光度值达 0.2 左右使的时间而恒定反应时间。 五、酶标仪判读结果 1、显色反应终止后应立刻比色(30 分钟内) 。 2、常见的显色系统有 OPD 和 TMB 二种,以后者最为常见,而 TMB 酸不易终 止因此必须尽快比色以免影响结果。OPD 终止后显棕色,测定波长为 490nm;TMB

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