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HIV实验室SOP文件54


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成高子镇中心卫生院检验科

责 任 部 门 文 件 编 号 版 次 / 页 码

检 验 科

HIV 筛查实验点 SOP 文件

SOP-MY-HIV-5
第 1 版第 1 次修改 第 17 页 共 70 页

1996 年美国 FDA 首次批准 HIV-1 尿液 ELISA 试剂,我国也正在研制尿液 HIV 抗体检测试剂。主要适用于静脉注射毒品(IDUs)人群和其它高危人群的大面积 流行病学调查、监测。筛查阳性者仍需采血做确认试验才能确定。 4、筛查试验 根据检测目的选用符合要求的筛查试剂对样品进行初筛和重复检测(复检) 。 5、初筛试验:以第三代 ELISA(双抗原夹心法)为例。 (1)实验准备:试验开始前将试剂和样品放置在室温(18?23℃), 按实验室 SOP 做好试剂准备。 磷酸盐缓冲液:若液体内有结晶,应放置在 37℃直至溶解,用蒸馏水 1:25 稀释浓缩液,4℃保存 2 周。 TMB 底物液:使用前配制,TMB 液和过氧化脲液等量混匀。 1M 硫酸终止液:85 ml 蒸馏水中加入 5 ml 浓硫酸。 备好试剂盒、待检样品和外部对照质控血清后,按试剂盒说明书以及质控和 安全防护要求进行筛查检测。 (2)实验操作 ①、装好所需使用数目的孔条,每孔均加入 100μ l 样品稀释液。设 3 个阴性 对照孔,1 个 HIV-1 阳性对照孔,若需要可再设 1 个 HIV-2 阳性对照孔。 ②、每孔加入 50μ l 待检样品及对照(对照要后加) ,未用孔用样品稀释液 加满以溶解结合物球,以免堵塞洗板机孔。可震摇 15S,37±2℃孵育 60±5min。 ③、置洗板机上洗涤 6 遍(用洗液将反应孔完全加满,静置 30?60S,共洗涤 6 遍,洗完后孔上方及底部不应残存液体,禁止在滤纸上拍干) 。 ④、每孔加入 100μ l 底物液,勿搅动,室温避光孵育 30±2min。 ⑤、每孔加入 100μ l 1M 硫酸终止反应,充分混匀。 ⑥、在 2h 内置于酶标仪读数,单波长 450nm,或双波长 450/630nm 测 OD 值。 (3)实验结果 ①、阴性对照(NC) ,HIV-1 阳性对照(PC1) ,HIV-2 阳性对照(PC2) 。 NC 必须<0.25 方可用,排除 NC≥0.25 的值,计算 NC 平均值。 NC 界限范围:0.6 倍 NC 均值<NC<1.4 倍 NC 均值。

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②、符合以下条件的实验成立: 两个以上的 NC 可用。

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第 1 版第 1 次修改 第 18 页 共 70 页

PC1-NC 均值 ≥ 0.4,PC2-NC 均值 ≥ 0.4。 ③、Cut off 值 = 阴性对照均值 + 0.100。 小于 Cut off 为阴性,大于或等于 Cut off 为阳性。 (4)报告:对呈阴性反应的样品,可由实施检测的实验室出具 HIV 抗体阴 性报告;对呈阳性反应的样品,须进行复检,不能出阳性报告。 6、复检试验: 对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或不同厂家的筛 查试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应,则报告 HIV 抗体阴性;如均呈 阳性反应,或一阴一阳,需送艾滋病确认实验室进行确认(见图 1) 。
样 品 筛查试剂 初筛检测 阳性反应 阴性反应

原有试剂加另外一种筛查试剂

重复检测

均阳性反应

一阴一阳

均阴性反应

送确认实验室确认 图1 HIV 抗体筛查检测流程

报告阴性

7、初筛试验结果的报告 对 HIV 抗体筛查试验,呈阴性反应者可出具“HIV 抗体阴性”报告(可用附 表 1) ;对初筛试验呈阳性反应者不能出阳性报告,可出具“HIV 抗体待复查”报
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告(附表 1) 。

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第 1 版第 1 次修改 第 19 页 共 70 页

8、初筛试验呈阳性反应样品的转送 如需送上级实验室进行复测或确认,需要填写“HIV 抗体复测送检单” (附表 2) ,经 1 名检验人员和 1 名具有中级以上技术职称的人员审核签字。送当地艾滋 病筛查中心实验室,再转送艾滋病确认实验室,或在本实验室复检后直接送确认 实验室。 9、对筛查阴性和阳性者,均需做好检测后咨询。

十三、检测结果的判定方法
1、HIV 测定(胶体金法)结果的判定方法 (1) 、阳性:出现两条或三条红线均为阳性反应。 (2) 、阴性:仅出现质控一条红线,则实验结果为阴性。 (3) 、无效:如无红线(或只有反应线)出现,表明实验无效,须重新检测。 2、HIV 测定(ELISA 法)结果的判定方法 (1) 、计算临界值 CO(cut-off)值。 (2) 、临界值=阴性对照 A 均值+0.12 (3) 、正常情况下,阴性对照孔的 OD 值≤0.10(若 1 孔阴性对照的 OD 值> 0.1 应舍弃,若有 2 孔或 2 孔以上阴性对照的 OD 值>0.1,应重复实验。 ) 。样品 OD 值<临界值者为 HIV 抗体阴性。 (4) 、正常情况下,阳性对照孔的 OD 值≥0.80(若 1 孔阳性对照的 OD 值< 0.8 应舍弃,若有 2 孔或 2 孔以上阳性对照的 OD 值<0.8,应重复实验。样品 OD 值≥临界值者为 HIV 抗体阳性。 3、HIV 测定(蛋白印迹法)结果的判定方法 根据卫生部 1990(2)号文件的规定,蛋白印迹法的判断标准为: (1) 、阳性:至少有一条 env(gp160,gp120,gp41)带和一条 pol(p65,p51, p32)带或至少有一条 env 带和一条 gag(p55,p24,p18)带或至少有一条 env 带和 一条 gag 带,一条 pol 带或至少 2 条 env 带。 (2) 、阴性:无病毒特异带。
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第 1 版第 1 次修改 第 20 页 共 70 页

(3) 、可疑:一条 gag 带和一条 pol 带或只有 gag 带或只有 pol 带。

十四、检测结果报告规程
1、从事 HIV 检测工作的技术人员必须接受过上岗前的培训和定期复训。 2、HIV 检测工作必须在独立的实验室内进行。 3、初筛检测试剂必须是经国家食品药品监督管理局注册批准、中国药品生 物制品检定所批批检合格且在有效期内的试剂。 4、按照《全国艾滋病检测技术规范》的要求建立健全质量管理制度、实验 室安全标准操作规程、安全防护工作等。 5、检测结果报告前应填写好原始实验记录资料,包括试验日期,试验操作 记录,检测样品及空白、阴、阳对照结果,S/CO 值、临界值、试剂厂家、批号、 效期,检测人、复核人签名等。 6、将试验结果存档保存,处理试验废物,擦净实验台,做好实验室消毒卫 生。 7、结果报告:对呈阴性反应的样品,可出具“HIV 抗体筛查报告” (见附表 1)阴性报告;对呈阳性反应的样品,须进行复检,不能出阳性报告。 8、复检试验:对初筛呈阳性反应的样品用原有试剂和另外一种不同原理或 不同厂家的筛查试剂重复检测。如两种试剂复测均呈阴性反应,则报告“HIV 抗 体筛查报告” (见附表 1)阴性;如均呈阳性反应,或一阴一阳,则应按照《全国 HIV 检测管理规范》的要求送艾滋病确认实验室进行确证试验。

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